蛋白質純化是利用基因工程技術將編碼蛋白質的核酸序列導入宿主細胞，使其大量表達，然后采用合適的純化方法進行體外純化，以獲得高純度、高活性和高產量的蛋白質的過程。那么你知道蛋白質純化操作步驟嗎？讓我們一起來看看吧！

1、構建原核表達質粒：目的基因PCR，載體酶切，連接，轉化，挑單克隆送測序；

2、將構建成功的質粒轉化到BL21（DE3）中，37℃培養過夜，挑單克隆小搖過夜；

3、小誘導摸索最佳誘導條件：將搖過夜的菌液1:1000接種到3mL LB中，37℃搖4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同濃度IPTG（0.1-1mM），不同溫度下誘導，隨著溫度降低，誘導時間延長，如37 ℃ 誘導4-5h，30°C誘導6h-8h，16°C誘導16-20h，取不同誘導條件下誘導前和誘導后的菌液，跑膠，考染，觀察誘導結果；（一般來說，IPTG濃度越低，誘導溫度越低，目的蛋白表達越慢，越利于蛋白質的正確折疊從而增加其可溶性，減少包涵體的產生）

4、找到最適誘導條件后，將菌液1:1000接種到2L的LB中，37℃搖至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑膠(1)，然后在預實驗得到的合適的誘導條件下誘導蛋白表達，吸出20μL菌液留待跑膠(2)；

5、取出誘導后的菌液，4000g，4℃離心15min；

6、棄上清液，稱重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制劑），重懸，冰上放置約30min；

7、壓力破碎：放掉高壓均質儀中的酒精，用水沖兩遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加壓（壓力不要超過800kpa），菌液過三到五遍至透明不粘稠；

8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃離心20min，將上清和沉淀分離，各留取20μL樣品(3)(4)待跑膠；

9、將2mL Ni-NTA加入純化柱，待乙醇濾過，用水沖洗，加入Lysis buffer平衡柱子；

10、用Lysis buffer將Ni-NTA重懸加入上清中，混勻，4℃搖床孵育2h；

11、將上清液4℃過柱，收集濾過液20μL(5)；

12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集濾過液樣品20μL(6)；

13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脫液，重復5次，收集5mL洗脫液于同一管中，留取20μL樣品(7)；

14、將實驗過程中得到的各個蛋白樣品跑膠，考馬斯亮藍染色1h，脫色至背景藍色較淺，可見清晰蛋白條帶；

15、分析各個樣品的蛋白條帶情況，根據結果進行后續操作：若洗脫蛋白樣品中蛋白無雜帶或雜帶少且淺，可進行透析與濃縮，若雜帶多則需要再次純化后進行透析與濃縮。

16、透析：將樣品加入透析膜中，兩端夾緊，4℃透析過夜；

17、濃縮：根據樣品分子量大小選擇合適的濃縮管4℃低速濃縮，濃縮后測蛋白濃度，分裝標記，在液氮中速凍，然后凍存于-80℃冰箱。

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