簡介

16 SrRNA PCR在臨床診斷及流行病調(diào)查中的應(yīng)用是采用16S rRNA基因克隆文庫的方法分析菌群組成已廣泛應(yīng)用于環(huán)境和臨床微生物中，它既可以分析標(biāo)本中細(xì)菌的種類，又可以反映標(biāo)本中各種細(xì)菌的相對比例，可以相對定量。

原理

16 SrRNA PCR在臨床診斷及流行病調(diào)查中的應(yīng)用的基本原理是細(xì)菌的核糖體RNA (rRNA)按沉降系數(shù)分為5S、16S 和23S,其編碼基因(rDNA) 長度依次為120個、1540個及3300個核苷酸。

典型的原核生物大腸桿菌核糖體是由50S大亞基和30S小亞基組成的。在完整的核糖體中，rRNA約占2/3,蛋白質(zhì)約為1/3。50S大亞基含有34種不同的蛋白質(zhì)和兩種RNA分子，相對分子質(zhì)量大的rRNA的沉降系數(shù)為23S,相對分子質(zhì)量小的rRNA為5S。

30S小亞基含有21種蛋白質(zhì)和一一個16S的rRNA分子。rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成，在細(xì)菌中高度保守。rRNA基因包含5'端到3'端的若干種成分，分別是16S rDNA、間區(qū)、23SrDNA、間區(qū)和5SrDNA。

16SrDNA基因是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對應(yīng)的DNA序列，它集保守性和變異性于一身，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中。

用途

16 SrRNA PCR可用于細(xì)菌的檢測、鑒定、監(jiān)測及系統(tǒng)進(jìn)化研究。

材料與儀器

器材：臨床標(biāo)本DNA/RNA提取試劑盒，細(xì)菌基因組提取試劑盒，普通PCR試劑盒，熒光定量PCR試劑盒，反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DNA測序儀等。

步驟

獲得目的16S rDNA有兩種方法(見圖12-6)。

（一）從基因組直接擴(kuò)增法

A. 從微生物樣品中直接提取總DNA對已知的純培養(yǎng)的微生物可通過培養(yǎng)富集后再進(jìn)行提取。

①細(xì)菌培養(yǎng):將細(xì)菌接種于5 ml液體培養(yǎng)基中，37 °C搖床(300 r/min) 培養(yǎng)過夜。
②細(xì)菌收集:取1 ml培養(yǎng)物于1.5 mlEP管中，室溫8000 r/min離心5 min,棄上清，沉淀重新懸浮于1 ml TE (pH8.0)中(用ddH2O也行)。
③菌體裂解:加入6 μl 50 mg/ml的溶菌酶，37 °C作用2 h。

再加2 mol/L NaCl 50 μl、10% SDS 110 μl、20 mg/ml 的蛋白酶K 3 μl，50 °C作用3 h或37 °C過夜。(此時菌液應(yīng)為透明黏稠液體)
④抽提:菌液均分到兩個1. 5 ml EP管，加等體積的酚~氯仿-異戊醇(25 : 24 : 1)，混勻,室溫放置5~ 10 min。

12000 r/min 離心10 min。 抽提兩次。(上清很黏稠，吸取時應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去)
⑤沉淀:加0. 6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。12000 r/min 離心10 min。
⑥洗滌:沉淀用75% 的乙醇洗滌。
⑦抽(涼)干后，溶于50 μlddH2O中，取2~5 μl電泳。作PCR模板用。

此外也可使用市售細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒獲得較純的基因組DNA。

B.從醫(yī)學(xué)標(biāo)本或樣品中提取基因組DNA如果提供的材料是醫(yī)學(xué)標(biāo)本或樣品則直接提取基因組DNA而不要培養(yǎng)，此方法如下:
液體標(biāo)本高速離心(12000 r/min) 10min， 沉淀加50μl“標(biāo)本預(yù)處理液"，37 °C 孵育30 min,12000r/ min離心10 min,沉淀待用;組織標(biāo)本直接加等量“標(biāo)本預(yù)處理液"，操作同上述。

處理后的標(biāo)本加入30 μl專用裂解試劑(可購自北京美萊博醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)，振蕩儀上振蕩5 min,使標(biāo)本與試劑充分混合，然后煮沸10 min，使標(biāo)本中的核酸物質(zhì)che底釋放并溶解在緩沖液中;離心后上清即可進(jìn)行PCR。

C.PCR擴(kuò)增rDNA對已知的純培養(yǎng)的微生物可以設(shè)計特異引物，在GenBank搜索同種的菌種的rDNA序列，一般同種的 rDNA序列有99% 以上的-致性。設(shè)計好的引物通過BLAST比對驗(yàn)證其特異性。
對醫(yī)學(xué)標(biāo)本或樣品則可設(shè)計通用引物擴(kuò)增目的16S rDNA。

如:
正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
反向引物5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

D.純化凝膠電泳檢測后 可使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化擴(kuò)增DNA。

（二）rRNA反轉(zhuǎn)錄法

A. 取16SrDNA序列的方法能夠區(qū)分被檢測的細(xì)胞是否為活體細(xì)胞。對未知序列的rRNA要測序，應(yīng)該對目的rRNA進(jìn)行純化。

B.以同源已知的rRNA序列為模板設(shè)計引物，RT-PCR獲得c-rDNA再測序。.

C.CDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系共20μl,包括細(xì)胞總RNA 2 μg/2μl, 50 U/μl Rnasin 1 μl，5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μl，10 mmol/L dNTPs 2μl，50 μg/ml 隨機(jī)引物2 μl，200 U/μl M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl, DEPC 8 μl。37 ℃反應(yīng)60 min，95 °C 5 min終止反應(yīng)。cDNA 在- 80 °C 保存或進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注意事項：如果實(shí)驗(yàn)對象是純培養(yǎng)物，則可以按上述方法獲得rDNA后直接測序。對于從樣品標(biāo)本中獲得的rDNA,需構(gòu)建16S rDNA文庫，然后挑取單克隆測序。

注意事項

1.采用PCR技術(shù)可以一-次性從混合DNA或RNA樣品中擴(kuò)增出16SrRNA序列，但也同樣會出現(xiàn)PCR所固有的缺點(diǎn)，尤其是采用16SrRNA保守序列的通用引物對多種微生物混合樣品進(jìn)行擴(kuò)增，可能出現(xiàn)嵌合產(chǎn)物(chimeric product)和擴(kuò)增偏嗜性現(xiàn)象。

2.采用16SrRNA基因克隆文庫的方法分析菌群組成，既可以分析標(biāo)本中細(xì)菌的種類，又可以反映標(biāo)本中各種細(xì)菌的相對比例，可以相對定量。但不是絕對定量，即標(biāo)本中菌群的比例與克隆文庫中對應(yīng)單克隆的比例相關(guān)，但不是直線相關(guān)。

3.16SrDNA基因克隆文庫不能完quan反映標(biāo)本的真實(shí)情況，有些細(xì)菌的比例太低，或有的細(xì)菌的rDNA不能用通用引物擴(kuò)增出來而無法在克隆文庫中出現(xiàn)。前者可通過加大文庫量來解決，后者可通過設(shè)計兼并引物和多對引物同時使用部分解決。