繼推出《細胞培養過程中如何避免內毒素的不良影響》《細菌內毒素的檢測方法》后，有沒有小伙伴想知道細菌內毒素如何去除呢？今天讓我們一起答疑解惑！

前言：19世紀，Ernstvon Bergmann提出了毒素的概念，他認為腐爛的液體含有一種水溶性但不溶于酒精、耐熱、不揮發的物質，這種物質會引起疾病癥狀。20世紀初，Pfeie等學者提出了內毒素的名稱，確定了整個細菌家族擁有基本相同的毒素，并發現了內毒素的熱原性和毒性之間的密切關系。20世紀中葉，Lüderitz 和Westphal等學者從患者血清中分離出內毒素，而將多糖和脂質等非蛋白質的部分命名為脂多糖(LPS)。此后對內毒素脂多糖的化學表征發展迅速，相繼開展內毒素脂多糖的核心多糖、空間結構、衍生物、類似物的化學合成和生物分析。細菌內毒素結構分為三個部分: 類脂A(Lipid A)、核心多糖(Corepolysaccharide)和一系列重復的氧多糖側鏈(O-polysaccharide side chain)。

 細菌內毒素如何去除？

細菌內毒素，特別是脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的一種成分，對生物制品，尤其是基于大腸桿菌表達的病毒樣顆粒(VLP)疫苗的生產構成了重大挑戰。內毒素的復雜結構和穩定性使其難以通過常規純化技術去除，且其生物活性強，即使是微量殘留也可能對疫苗的安全性和有效性構成威脅。同時，內毒素不是蛋白質，其熱穩定性使得它即使在100℃的高溫下加熱1小時也不會被破壞。在更高的溫度(如115℃)下濕熱處理30分鐘，也只能破壞大約25%的熱原質。為了ce di破壞內毒素的生物活性，需要采用更高的溫度和更長的處理時間，如180℃下干烤3-4小時或250℃下干烤1-2小時。此外，強堿、強酸或強氧化劑加溫煮沸30分鐘才能有效破壞內毒素。以下介紹幾種比較常見的去除細菌內毒素的方法。

1. 膜過濾法

膜過濾法是一種物理去除內毒素的方法。由于內毒素分子相對較大，通過選擇合適的膜孔徑和操作條件，可以實現內毒素的有效截留。然而，這種方法需要特別注意膜的選擇和操作參數的優化，以避免對目標蛋白或VLP造成損失。

2. 親和層析法

親和層析法利用特定的層析介質對內毒素的親和性進行去除。通過優化層析條件，如pH值和離子強度，可以進一步提高去除效率和降低蛋白損失。這種方法具有高效、選擇性好的優點，但需要針對具體的生物制品進行優化。特別是免疫吸附劑在生產中的運用使得生物大分子的純化變得簡單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標蛋白作為抗原，將通過雜交瘤技術生產的單克隆抗體偶聯于介質上，此介質來吸附目標蛋白。由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標蛋白吸附于介質上，內毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無熱原產品。

實際上，由于介質本身存在的非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白和內毒素同時被吸附，但內毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產中，洗脫物內毒素含量一般為0.25EU/mL。

3. 密度梯度超離心法

密度梯度超離心法依據內毒素與其他溶液組分在密度、沉降系數等方面的差異進行分離。然而，由于內毒素的存在形式多樣，這種方法的應用受到一定限制，且操作復雜，成本較高。

4. 活性炭吸附法

活性炭吸附法適用于小分子溶液或水中的內毒素去除。然而，它對有效成分也有吸附作用，且殘留的活性炭不易去除，因此在實際應用中需要謹慎考慮。

5. 分子篩法(凝膠過濾層析)

分子篩法利用凝膠分子篩的空間網狀結構進行過濾層析，適用于蛋白分子量較小的溶液。這種方法操作簡便，但對內毒素的去除效率可能不如其他方法高。

內毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為1000kDa分子聚集體，它與多數生物蛋白分子量差異較大，基于這一特征，可以采用凝膠過濾層析，將大分子內毒素分子與目標蛋白分離。但其處理量小, 處理時間較長。

6. 化學處理法

化學處理法通過使用特定的化學物質，如Triton X-114進行兩相分離，可以有效去除LPS。然而，這些化學物質可能會對VLP的結構造成損害，因此需要在使用前進行充分的評估和優化。

7. 離子交換層析法

LPS帶有負電荷，因此可以通過離子交換層析法進行去除。這種方法操作簡便，且對目標蛋白的損失較小。然而，需要針對具體的生物制品選擇合適的離子交換介質和操作條件。

對于陰離子交換層析，內毒素在pH>2時帶負電荷，與陰離子交換介質Q或DEAE有較強結合, 可使用目標蛋白從陰離子交換填料流穿的方式去除內毒素；也可在目標蛋白和內毒素同時結合于層析介質上后，由于內毒素的結合能力較蛋白的結合能力強，因此可先將目標蛋白洗脫出來，然后再用高鹽緩沖液或NaOH將內毒素洗出。

對于陽離子交換層析，在pH4.0時，內毒素還是帶有負電荷不能和填料結合而隨流動相流出層析柱，目標蛋白則可以與陽離子交換介質結合，因此采用陽離子交換層析也可以很好的去除內毒素。此外，采用一些表面活性劑比如Triton X-114，既能阻止內毒素結合在陰離子柱上也可阻止內毒素結合在陽離子柱上。

8. 聚合物沉淀法

這種方法主要依賴于特定的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，來沉淀出內毒素(如LPS)。這種方法操作簡便，意味著它不需要復雜的設備或高深的技術知識。然而，要實現最佳效果，必須嚴格控制聚合物的濃度和操作條件。這是因為過高的濃度或不當的操作條件可能會對目標蛋白造成損失，從而影響最終產品的質量和純度。

9. 遺傳工程改造法

近年來，通過遺傳工程改造大腸桿菌菌株，使其內毒素生物合成途徑發生變化，從而產生脂質IVA而非完整的內毒分子，成為了一種新的去除內毒素的方法。脂質IVA是內毒素的前體，不會觸發人類典型的內毒素反應，因此是生產治療性蛋白的更安全選項。這種方法為生物制品的生產帶來了重大進步，因為它可能消除了表達后進行昂貴且效率低下的內毒素去除過程的需求。

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