一、實(shí)驗(yàn)原理

?鎳柱純化實(shí)驗(yàn)的原理基于固定化金屬離子親和色譜(IMAC)?，這是一種利用金屬離子與配體之間的特異性相互作用來(lái)分離蛋白質(zhì)的方法。鎳柱純化利用Ni2+與帶有咪唑基團(tuán)的組氨酸(His)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)目的蛋白的純化。具體來(lái)說(shuō)，鎳柱中含有Ni2+離子，這些離子能夠與組氨酸上的咪唑基團(tuán)形成配位鍵，從而選擇性結(jié)合帶有His標(biāo)簽的目的蛋白。由于不帶His標(biāo)簽的蛋白無(wú)法與Ni2+形成配位鍵，因此能夠有效地區(qū)分目的蛋白與非目的蛋白。

在純化過(guò)程中，首先通過(guò)Binding buffer平衡鎳柱，接著將蛋白質(zhì)樣品上樣到鎳柱上。此時(shí)，帶有His標(biāo)簽的目的蛋白會(huì)與鎳柱上的Ni2+結(jié)合，而非目的蛋白則流穿鎳柱。隨后，通過(guò)增加咪唑濃度的Washing buffer洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白。最后，使用高濃度的咪唑緩沖液（Elution buffer）與His標(biāo)簽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ni2+，從而將目的蛋白洗脫下來(lái)，完成純化過(guò)程。

二、操作步驟

① 準(zhǔn)備工作：

（1）根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，選擇合適的鎳柱類型和洗脫方式，配制合適PH值的緩沖液和洗脫液。

（2）緩沖液和洗脫液在蛋白純化操作前用0.45 μm或0.22 μm濾頭過(guò)濾除菌避免污染鎳柱，減少壽命。

② 樣品預(yù)處理：

預(yù)處理待純化的蛋白樣品，如離心去除雜質(zhì)、調(diào)整樣品的pH值、低濃度咪唑溶液透析以去除培養(yǎng)基中的EDTA和鹽溶液等（具體操作需根據(jù)蛋白性質(zhì)設(shè)計(jì)）。

③ 鎳柱平衡及上樣：

利用無(wú)咪唑或低濃度咪唑的緩沖液對(duì)鎳柱進(jìn)行平衡，待曲線維穩(wěn)10 min左右，即平衡結(jié)束。平衡完成后，將處理完畢的樣品緩慢且勻速地加入鎳柱中，使目的蛋白與鎳柱充分結(jié)合。

④ 除雜：

使用低濃度咪唑緩沖液（如2、5 、10、20、25 mM咪唑）沖洗鎳柱，去除與鎳柱非特異性結(jié)合的雜蛋白。該過(guò)程應(yīng)合理控制流速和時(shí)間，以確保雜蛋白被wan全去除。

⑤ 洗脫：

為收集高純度的目的蛋白，使用含有高濃度咪唑的洗脫液將目的蛋白從鎳柱上洗脫下來(lái)。通過(guò)梯度洗脫的方式，逐步增加洗脫液中咪唑的濃度（如50、100、200、300、400、500 mM咪唑）。在目的蛋白shou次純化實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)設(shè)置多個(gè)從低至高咪唑濃度的緩沖液，探索合適的洗脫條件。

⑥ 收集與分析：

收集含目的蛋白的洗脫液樣品，利用SDS-PAGE電泳等方法對(duì)其進(jìn)行分析以評(píng)估其純度和濃度。

⑦ 清洗與保存：

使用ddH₂O沖洗鎳柱，并用20%乙醇溶液沖洗并保存鎳柱以防止微生物生長(zhǎng)。

三、注意事項(xiàng)

① 在實(shí)驗(yàn)前查詢并了解目的蛋白的性質(zhì)（分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成、聚體等），并嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如緩沖液的pH值和咪唑濃度，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

② 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，并且樣品在上柱前需要進(jìn)行預(yù)處理（高速離心、調(diào)PH或透析等），以保護(hù)鎳柱，避免污染和損傷。

③ 在鎳柱的使用中，應(yīng)避免緩沖液中存在還原劑和螯合劑，以免 Ni²⁺ 被還原而脫落。

④ 鎳柱純化的效率受到多種因素的影響，包括蛋白質(zhì)表面可結(jié)合的氨基酸的種類、數(shù)目和分布，金屬離子的種類和密度，以及層析條件（如pH值、鹽的種類和濃度、添加劑等）。通過(guò)優(yōu)化這些條件，可以提高純化的效率和目的蛋白的純度。此外，鎳柱在使用一段時(shí)間后可能需要再生，以去除積累的雜蛋白并重新活化鎳柱，以保證其長(zhǎng)期有效的使用?。

⑤ 盡量收集鎳柱純化過(guò)程中每一步產(chǎn)生的洗脫液，以便實(shí)驗(yàn)結(jié)束后利用SDS-PAGE等方法對(duì)蛋白純化過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步分析。

四、緩沖液推薦

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