產品名稱：abcam重組Drebrin抗體[EPR12634] (ab178408)現貨供應

產品貨號：ab178408

產品品牌：abcam

實驗流程：

蛋白質印跡實驗方案：

1. 樣品裂解

l 從細胞培養物中制備裂解物

(1) 將細胞培養皿放在冰上，用冰冷的PBS清洗細胞。

(2) 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解緩沖液（每 10 mL7細胞/100 mm 培養皿/150 cm2瓶;每 5x10 0.5 mL6細胞/60 mm 培養皿/75 cm2燒瓶）。

(3) 使用冷塑料細胞刮刀從培養皿上刮下貼壁細胞，然后輕輕地將細胞懸液轉移到預冷的微量離心管中。或者，在微量離心管中的裂解緩沖液中重懸之前，可以胰蛋白酶消化并用PBS洗滌細胞。

(4) 在 4°C 下保持恒定攪拌 30 分鐘。

(5) 在4°C的微量離心機中離心細胞懸液。 您可能需要根據細胞類型改變離心力和時間;指南是在 14,000–17,000 g 下 5 分鐘，但這必須為您的實驗確定（白細胞需要非常輕的離心）。

(6) 輕輕地從離心機中取出試管并放在冰上，吸出上清液并放入保持在冰上的新鮮試管中，然后丟棄沉淀。

l 從組織中制備裂解物

(1) 用干凈的工具解剖感興趣的組織，最好在冰上解剖，并盡快防止蛋白酶降解。

(2) 將組織放入圓底微量離心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中以快速冷凍。將樣品儲存在 -80°C 以備后用，或放在冰上立即均質化。對于~5mg組織，向試管中快速加入~300μL冰冷裂解緩沖液，用電動均質器勻漿，用另一個2×200μL裂解緩沖液沖洗刀片兩次，然后在4°C下保持恒定攪拌2小時（例如，放在冰箱中的軌道振蕩器上）。裂解緩沖液的體積必須根據存在的組織量來確定;蛋白質提取物不應太稀釋，以免蛋白質損失和大量樣品上樣到凝膠上。濃度下限為 0.1 mg/mL，最佳濃度為 1–5 mg/mL。

(3) 在微量離心機中以 14,000–17,000 g 在 4°C 下離心 5–10 分鐘。輕輕地從離心機中取出試管，放在冰上，吸出上清液，然后放入保持在冰上的新鮮試管中;丟棄顆粒。

2. 樣品制備

(1) 除去少量裂解物以進行蛋白質定量測定。確定每種細胞裂解物的蛋白質濃度。

(2) 確定要加載多少蛋白質并加入等體積的 2X Laemmli 樣品緩沖液。

(3) 我們建議使用以下方法對樣品進行還原和變性，除非在線抗體數據表表明應使用非還原和非變性條件。

(4) 為了減少樣品和變性，將每個細胞裂解物在樣品緩沖液中在100°C下煮沸5分鐘。裂解物可以等分并儲存在 -20°C 以備將來使用。

3. 抗體染色

(1) 使用封閉緩沖液在室溫下封閉膜1小時或在4°C下過夜。

(2) 在封閉緩沖液中用適當稀釋的一抗孵育膜。我們建議在 4°C 下孵育過夜;其他條件可以優化。

(3) 用三次TBST洗滌膜，每次5分鐘。

(4) 在室溫下，在封閉緩沖液中用推薦的偶聯二抗稀釋液孵育膜1小時。

(5) 用三次TBST洗滌膜，每次5分鐘。

(6) 對于信號開發，請遵循套件制造商的建議。去除多余的試劑并用透明保鮮膜覆蓋膜。

(7) 使用用于化學發光的暗室顯影技術或用于比色檢測的普通圖像掃描方法獲取圖像。

相關文獻：

[1] Brezovakova V et al. Astrocytes Derived from Familial and Sporadic Alzheimer's Disease iPSCs Show Altered Calcium Signaling and Respond Differently to Misfolded Protein Tau. Cells 11:N/A (2022).

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