NEB-Q5定點突變試劑盒（不含感受態細胞）可以在 2 小時內快速對雙鏈質粒DNA進行定點突變。該試劑盒使用穩定的Q5熱啟動超保真 DNA 聚合酶，結合客戶自行設計的引物，在各種質粒中引入插入、缺失和替換突變。PCR 后將擴增材料直接添加到du特的激酶-連接酶-DpnI（KLD）酶混合液中，進行快速室溫環化和模板去除（5 分鐘）。操作方便、簡單，只需一天時間便可完成整個操作，并且不受載體、宿主菌的限制。

操作使用：

步驟 I：指數擴增 （PCR）

1. 將以下試劑組裝在薄壁PCR管中。

2. 將試劑wan全混合，然后轉移到熱循環儀中。

3. 執行以下循環條件： 常規PCR的熱循環條件：

* 有關誘變引物的 Q5 優化退火溫度，請使用在線 NEB 引物設計軟件 NEBaseChanger™。對于預先設計的背靠背引物組，可以應用 Ta = Tm + 3 規則，但可能需要進行優化。

注意：我們建議通過在瓊脂糖凝膠上觀察 2–5 μl 反應來確保 PCR 產物干凈。

第二步：激酶、連接酶和DpnI（KLD）處理

1. 組裝以下試劑：

2. 上下移液充分混合，在室溫下孵育 5 分鐘。

第三步：轉型

1.在冰上解凍50μl化學感受態大腸桿菌細胞[NEB 5-α感受態大腸桿菌（高效），NEB #C2987]。

2.將步驟II中的5μlKLD混合物加入解凍的細胞管中。小心地輕彈管子 4-5 次以混合。不要渦旋。

3. 將混合物放在冰上 30 分鐘。

4.在42°C下熱休克30秒。

5. 放在冰上 5 分鐘。

6. 將 950 μl 室溫 SOC 移液到混合物中。

7. 在 37°C 下振蕩 （250 rpm） 孵育 60 分鐘。

8. 通過輕彈試管和倒置徹di混合細胞，然后將 50-100 μl 鋪展到選擇板上，并在 37°C 下孵育過夜。 可能需要（特別是對于簡單的替換和刪除實驗）在鋪板之前將 SOC 中的轉化混合物稀釋 10 到 40 倍，以避免菌落的草坪

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