熒光標記在生物學眾多的研究領域中有著十分廣泛的應用，已經成為研究體內或細胞成像及生物細胞功能的重要工具。熒光標記方式一般有兩種，一種是細胞表達的熒光蛋白，另外一種是化學合成的熒光分子，此外，螢光素酶也是細胞標記的常用方法。每一種熒光分子都有其獨te的激發波長和發射波長。螢光素酶不同于熒光分子，其發光機制是利用酶與底物的反應，催化發出的化學發光，其發光并不需要激發光的參與，常用于體內成像及螢光素酶報告基因的定量實驗。熒光蛋白如何選擇呢？讓我們一起來看看吧！

一、激發波長/發射波長

每一種熒光蛋白都有其獨te的激發波長和發射波長，因此，選擇的熒光蛋白必須是手上系統能夠激發和檢測得到的。舉例，如果你的顯微鏡只有488nm和561nm兩個激發器，那你就不能夠選擇遠紅外熒光蛋白。又比如當使用不止一個熒光蛋白時，確保他們的發射波長沒有重疊，建議熒光使用先后順序，GFP/RFP/BFP/YFP/CFP。

二、寡聚反應

第一代熒光蛋白易于寡聚化，當和目的基因融合表達時，可能會影響目的基因蛋白的生物學功能。因此做融合表達時建議使用單體的熒光蛋白，比如mCherry/EGFP。

三、氧氣

許多熒光蛋白的成熟需要氧氣，特別是衍生自GFP的那些熒光蛋白，如EGFP/ECFP/EYFP。如果這些熒光蛋白處于缺氧環境，那可能就觀察不到熒光。

四、成熟時間

成熟時間是熒光蛋白正確折疊和產生發色團所需的時間，時間可能是幾分鐘到幾小時。舉例：superfolder GFP (sfGFP) 和mNeonGFP在37°C所需時間小于10min；mCherry 需要大概15min；TagRFP 需要大概100min；DsRed 大概需要10hours。

五、溫度

溫度會影響熒光蛋白的成熟時間和熒光強度，比如EGFP適合37°C，所以EGFP最shi合哺乳動物或者細菌的研究，而GFPS65T相對適合酵母的研究。

六、亮度

熒光蛋白的亮度值由消光系數與量子產率的乘積計算得出。在許多情況下，將熒光蛋白的亮度與EGFP(設定為1)進行比較，有一些熒光蛋白非常暗淡（例如TagRFP657，其具有亮度只有0.1），因此亮度也需要考慮。

七、耐光性

長時間暴露在激發光下，熒光分子被漂白（即失去發光的能力）。光穩定性可短至100毫秒（如EBFP）或長達1小時（如mAmetrine1.2）。但是，對于大多數熒光蛋白來說，它只需幾秒鐘到幾分鐘。另外，光穩定性可能也會受實驗參數影響，例如激發光強度，pH或溫度等。

八、pH穩定性

如果計劃在酸性環境中表達熒光蛋白，則此參數非常重要，一些熒光蛋白具有不同的ex/em光譜（例如mKeima）或在pH變化時熒光強度會發生改變（例如pHluorin，pHTomato），sensGFP在酸性環境會淬滅，如StubRFP-SensGFP-LC3B自噬探針。

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